上海旦鼎講解 PCR注意事項(xiàng)
pcr注意事項(xiàng)
pcr產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間
一般為48h以內(nèi)，有些于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。
假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
pcr反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及， ④pcr循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加taq酶或溴乙錠。
引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是pcr失敗或擴(kuò)增條帶不 理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看od值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做pcr有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。
mg2+濃度：mg2+離子濃度對(duì)pcr擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低pcr擴(kuò)增的特 異性，濃度過(guò)低則影響pcr擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使pcr擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。
反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行pcr擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行pcr擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。
物理原因：變性對(duì)pcr擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低pcr擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是pcr失敗的原因之一。
靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其pcr擴(kuò)增是不會(huì)成功的。
假陽(yáng)性
出現(xiàn)的pcr擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。
引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行pcr擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的pcr產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。
靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出pcr產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式pcr方法來(lái)減輕或消除。
出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶
pcr擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、 或引物聚合形成二聚體。二是mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及pcr循環(huán)次數(shù) 過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。
出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
pcr擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量 差，dntp濃度過(guò)高，mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來(lái)源的酶。②減少dntp的濃度。適當(dāng)降低mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。
克隆pcr產(chǎn)物1)克隆pcr產(chǎn)物的優(yōu)條件是什么？
插入片段：載體比需實(shí)驗(yàn)確定。1：1（插入片段：載體）常為佳比，摩爾數(shù)比1：8或8：1也行。應(yīng)測(cè)定比值范圍。連接用5ul 2x連接液, 50ng質(zhì)粒dna,1weiss單位的t4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時(shí)，或4℃過(guò)夜。在這2種溫度下，缺t-凸出端的載體會(huì)自連，產(chǎn)生藍(lán)斑。室溫保溫1小時(shí)能滿足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率，需4℃過(guò)夜。
2)pcr產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？
如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見(jiàn)其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會(huì)產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。
3)如果沒(méi)有回收到目的片段，還需要作什么對(duì)照實(shí)驗(yàn)？
a）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。
如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。
b）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計(jì)算菌落生長(zhǎng)數(shù)，測(cè)定轉(zhuǎn)化效率。
例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用soc稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過(guò)夜，產(chǎn)生1000個(gè)菌落。轉(zhuǎn)化率為： 產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板dna的總量。
鋪板dna的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng dna，用soc稀釋到1000u后含10 ng dna，用1/10鋪板，共用1 ng dna。轉(zhuǎn)化率為：
1000克隆x10（3次方） ng /鋪板1 ng dna ug=10（6次方）cfu/ ug
轉(zhuǎn)化pgem-t應(yīng)用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞
如沒(méi)有菌落或少有菌落，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。
c）如用pgem-t正對(duì)照，或pcr產(chǎn)物，產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞），表明載體失去t?？赡苁沁B接酶污染了核酸酶。t4 dna連接酶（m1801，m1804，m1794）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無(wú)核酸酶污染，不應(yīng)用其它來(lái)源的t4 dna連接酶替換。
d）用pgem-t或pgem-t easy載體，連接pgem-t正對(duì)照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實(shí)驗(yàn)步驟，可得100個(gè)菌落，其中60%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑, 沒(méi)有菌落或少有菌落，連接有問(wèn)題。
4)對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好，卻沒(méi)有回收到目的片段，實(shí)驗(yàn)出了什么問(wèn)題？
a）連接用室溫保溫1小時(shí)，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率，需4℃過(guò)夜。
b）插入片段帶有污染，使3`-t缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和pgem-t正對(duì)照混合，再連接。如降低了對(duì)照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑，插入片段污染有核酸酶，使pgem-t或pgem-t easy載體3`-t缺失。
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