亓文寶：非洲豬瘟單克隆抗體研究進展
非洲豬瘟單克隆抗體研究進展
黃一凡、高琦、賈偉新、張桂紅、亓文寶
華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院
國家非洲豬瘟區(qū)域實驗室（廣州）
人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實驗室
農業(yè)部人畜共患病重點實驗室
農業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室
廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室
摘要：非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起豬的一種急性、出血性、高度接觸性、高死亡率的傳染病。從20世紀中期以來，已在非洲、歐洲和美洲等數(shù)十個國家流行，并在近幾年內蔓延至歐亞兩洲接壤處的格魯吉亞、亞美尼亞、阿塞拜疆、俄羅斯及中國，給各國養(yǎng)豬業(yè)帶來了極大的危害，目前尚無有效的疫苗和藥物用來預防或治療該病。非洲豬瘟單克隆抗體具有特異性強、高效、靈敏、便捷、成本低等特點，單克隆抗體在非洲豬瘟病毒快速診斷技術研究、致病機制、免疫機制和疫苗研制等方面有著重要的作用，加強對非洲豬瘟單克隆抗體研究意義重大，亟待進行。
關鍵詞：非洲豬瘟病毒；單克隆抗體；結構蛋白，p72蛋白
非洲豬瘟(african swine fever, asf)是由非洲豬瘟病毒(african swine fever virus, asfv)引起的一種急性、熱性、出血性豬傳染病，急性感染死亡率為100%。急性和亞急性asf常在多種器官上表現(xiàn)出嚴重的血管性病變，如腎臟出血、淋巴結彌漫性出血、肺水腫、脾臟充血性腫大、彌散性血管內凝血和血小板減少等。其主要臨床癥狀是高熱、皮膚發(fā)紺、有出血點、嘔吐和便血等。因此，asf被世界動物衛(wèi)生組織(oie)列為必須報告的法定動物疫病之一，我國將其列為一類動物疫病。1921年，在非洲的肯尼亞地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)asf。1957年，歐洲的葡萄牙第一次暴發(fā)asf疫情，經過一段時間沉默后，該病于1960年在歐洲的一些國家出現(xiàn)并逐漸傳播，2007年底進入俄羅斯。近年來東歐一些國家不斷發(fā)生疫情，國際疫情形勢十分嚴峻。2018年8月3日，農業(yè)農村部公布了遼寧省出現(xiàn)我國首例asf疫情。截至2019年5月13日，全國31個省(市、自治區(qū))和香港特別行政區(qū)先后出現(xiàn)130起疫情，給我國養(yǎng)豬行業(yè)及相關產業(yè)造成了巨大的經濟損失。
1.非洲豬瘟病毒的分類及結構特征
asfv是一種有囊膜的單分子線狀雙鏈dna病毒，屬于雙鏈dna病毒目、非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，也是目前已知的唯一的蟲媒dna病毒。家豬、野豬和軟蟬均為asfv的宿主，豬單核細胞-巨噬細胞為asfv主要的靶細胞。
病毒基因組全長約為170-190 kb，基因組中間是一段長度約為125 kb的保守區(qū)。asfv的基因組有150-167個開放閱讀框(orfs)，編碼150-200種蛋白質，其中約50種為結構蛋白，主要結構蛋白有p72、p54、p30、 p49、p220、p62和cd2v蛋白等。
2.非洲豬瘟病毒主要的結構蛋白
p72蛋白是asfv的主要結構蛋白之一，由b646l基因編碼。p72是病毒粒子二十面體衣殼的重要組成部分，產生于病毒感染的晚期，約占整個病毒粒子蛋白的32%。p72蛋白在非洲豬瘟病毒結合和進入受體細胞過程中有很重要的作用，并對病毒粒子衣殼的產生起著至關重要的作用[17]。非洲豬瘟病毒大多數(shù)毒株的毒力都很強，但是免疫原性很低，只有少數(shù)幾個蛋白具有免疫原性，有研究表明，不同區(qū)域asfv毒株誘導產生的p72抗體的相應抗原表位都相當保守。p72蛋白的反應原性和抗原性很穩(wěn)定，病毒感染后能夠產生高滴度的抗p72抗體，常被用來作為血清學檢測和免疫制劑。p72參與了病毒的吸附過程，針對p72的抗體可以阻斷病毒與巨噬細胞的結合。因此非洲豬瘟單克隆抗體的制備主要是針對p72蛋白。
p54蛋白同樣是非洲豬瘟病毒的重要結構蛋白，由e183l基因編碼，蛋白分子中含有一段跨膜區(qū)域，主要集中于衍生的內質網膜處。p54蛋白的跨膜結構區(qū)域對病毒蛋白經過內質網膜轉化成病毒包膜前體的過程十分重要，是非常重要的抗原蛋白。p54蛋白與細胞質動力蛋白dlc8可發(fā)生特殊的交叉反應，介導病毒的細胞內運輸，在細胞對病毒內攝過程和病毒在細胞內的加工過程中都起著重要作用。p54蛋白在非洲豬瘟病毒的感染早期能誘導caspase-9和caspase-3激活，激活細胞凋亡作用，進而誘發(fā)細胞吞噬，這是非洲豬瘟發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié)。
p30蛋白是非洲豬瘟的一種膜蛋白，由cp204l基因編碼，在病毒感染早期表達，能夠引起機體產生免疫反應，因此該蛋白也具有比較好的抗原性，是一種重要的抗原蛋白。研究表明，針對p30蛋白的抗體能夠抑制病毒內化，說明p30蛋白也參與病毒進入細胞的過程。
3.非洲豬瘟病毒的單克隆抗體研究
由單一b細胞克隆產生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體，稱為單克隆抗體。通常采用雜交瘤技術來制備，雜交瘤抗體技術是在細胞融合技術的基礎上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏b細胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細胞融合為b細胞雜交瘤。用具備這種特性的單個雜交瘤細胞培養(yǎng)成細胞群，可制備針對一種抗原表位的特異性抗體即單克隆體。
圖1.單克隆抗體制備過程
非洲豬瘟單克隆抗體對非洲豬瘟病毒的快速診斷、致病機制、免疫機制和疫苗的研制有著重大的作用。非洲豬瘟單克隆抗體(asfv mcab)一是用于免疫學相關asfv檢測方法的建立，例如用于建立檢測asfv抗原的直接免疫熒光試驗(dif)、免疫酶組化試驗、夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗等；二是用于病毒和抗原結構的研究及asfv抗原特性的研究及疫苗的研制。
4.國內外非洲豬瘟單克隆抗體研究進展
單克隆抗體具有特異性強，敏感性高的特點，從而廣泛應用于對病毒及其特異性抗血清的免疫學鑒定。
早在1984年，sanz等人就首次制備了針對asfv的單克隆抗體，獲得了241株穩(wěn)定的雜交瘤細胞，對其中90株(針對6個蛋白)進行了特異性試驗，對其中60株進行了分型。garcia-barreno等人于1986年發(fā)表于《journal of virology》上的論文，利用所制備的單抗(針對10個蛋白)識別asfv抗原性的改變，鑒定了來源于非洲、歐洲和美洲不同asfv毒株的抗原特性，并根據(jù)asfv抗原性的不同對asfv進行了分型。whyard等人于1985年制備了38株asfv的單抗(針對5個蛋白)，利用其中針對p72蛋白的單抗，建立免疫沉淀和免疫電鏡技術，并對p72蛋白進行了深入研究。zsak、cobbold等人于20世紀90年代先后制備了針對p72蛋白的單抗；2018年 mallory e. heimerman等人利用桿狀病毒表達系統(tǒng)制備了6株針對非洲豬瘟p72蛋白線性表位識別的單抗：mab 85 (aa 165–171)；mabs 65-3 and 6h9-1 (aa 265–280)；mabs 8f7-3 and 23 (aa 280–294)；and mab 4a4 (aa 290–303)。
國內學者朱紅等于2007年利用大腸桿菌表達的不溶性融合蛋白gst-p72，免疫小鼠制備了5株分泌p72的單抗雜交瘤細胞，用其制備的單抗經鑒定具有較好的特異性、穩(wěn)定性、敏感性及較強的生物學活性，并以此建立了相應的elisa檢測方法；曹琛福等采用原核表達的重組蛋白p54制備所得單抗，對其抗原表位進行鑒定，發(fā)現(xiàn)第23-29位、第36-45位、第72-94位、第114-120位和第137-150位氨基酸為p54蛋白抗原位點，有較強的特異性和高親和性，這也一定程度上證明了通過基因工程技術獲得重組蛋白替代病毒作為抗原來源是可行的。
5.展望
近年來，國內外運用基因工程技術獲得重組蛋白的方法變得越來越成熟、穩(wěn)定和有效，且利用原核表達系統(tǒng)(如大腸桿菌表達系統(tǒng))和真核表達系統(tǒng)(如桿狀病毒表達系統(tǒng))表達來獲得抗原也十分安全和快捷。通過眾多學者的研究，發(fā)現(xiàn)p72蛋白是asfv主要的結構蛋白，因此制備的單克隆抗體也主要針對p72蛋白。
單克隆抗體的試驗周期較長，環(huán)節(jié)也多，所以失敗的概率也很高。目前國內主要是針對p72蛋白來進行單克隆抗體的制備，也有針對較強抗原性的蛋白如p54和p30蛋白的單克隆抗體制備，但相對較少。如能在對p72蛋白深入研究的同時，對其他抗原性較強蛋白有更細致的研究，進一步制備出相應的單克隆抗體，將對asfv實驗室診斷技術、致病機制、免疫機制和未來疫苗的研制產生積極的推動作用。
來源：《豬業(yè)》2019年第3期
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p30蛋白是非洲豬瘟的一種膜蛋白，由cp204l基因編碼，在病毒感染早期表達，能夠引起機體產生免疫反應，因此該蛋白也具有比較好的抗原性，是一種重要的抗原蛋白。研究表明，針對p30蛋白的抗體能夠抑制病毒內化，說明p30蛋白也參與病毒進入細胞的過程。
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早在1984年，sanz等人就首次制備了針對asfv的單克隆抗體，獲得了241株穩(wěn)定的雜交瘤細胞，對其中90株(針對6個蛋白)進行了特異性試驗，對其中60株進行了分型。garcia-barreno等人于1986年發(fā)表于《journal of virology》上的論文，利用所制備的單抗(針對10個蛋白)識別asfv抗原性的改變，鑒定了來源于非洲、歐洲和美洲不同asfv毒株的抗原特性，并根據(jù)asfv抗原性的不同對asfv進行了分型。whyard等人于1985年制備了38株asfv的單抗(針對5個蛋白)，利用其中針對p72蛋白的單抗，建立免疫沉淀和免疫電鏡技術，并對p72蛋白進行了深入研究。zsak、cobbold等人于20世紀90年代先后制備了針對p72蛋白的單抗；2018年 mallory e. heimerman等人利用桿狀病毒表達系統(tǒng)制備了6株針對非洲豬瘟p72蛋白線性表位識別的單抗：mab 85 (aa 165–171)；mabs 65-3 and 6h9-1 (aa 265–280)；mabs 8f7-3 and 23 (aa 280–294)；and mab 4a4 (aa 290–303)。
國內學者朱紅等于2007年利用大腸桿菌表達的不溶性融合蛋白gst-p72，免疫小鼠制備了5株分泌p72的單抗雜交瘤細胞，用其制備的單抗經鑒定具有較好的特異性、穩(wěn)定性、敏感性及較強的生物學活性，并以此建立了相應的elisa檢測方法；曹琛福等采用原核表達的重組蛋白p54制備所得單抗，對其抗原表位進行鑒定，發(fā)現(xiàn)第23-29位、第36-45位、第72-94位、第114-120位和第137-150位氨基酸為p54蛋白抗原位點，有較強的特異性和高親和性，這也一定程度上證明了通過基因工程技術獲得重組蛋白替代病毒作為抗原來源是可行的。
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近年來，國內外運用基因工程技術獲得重組蛋白的方法變得越來越成熟、穩(wěn)定和有效，且利用原核表達系統(tǒng)(如大腸桿菌表達系統(tǒng))和真核表達系統(tǒng)(如桿狀病毒表達系統(tǒng))表達來獲得抗原也十分安全和快捷。通過眾多學者的研究，發(fā)現(xiàn)p72蛋白是asfv主要的結構蛋白，因此制備的單克隆抗體也主要針對p72蛋白。
單克隆抗體的試驗周期較長，環(huán)節(jié)也多，所以失敗的概率也很高。目前國內主要是針對p72蛋白來進行單克隆抗體的制備，也有針對較強抗原性的蛋白如p54和p30蛋白的單克隆抗體制備，但相對較少。如能在對p72蛋白深入研究的同時，對其他抗原性較強蛋白有更細致的研究，進一步制備出相應的單克隆抗體，將對asfv實驗室診斷技術、致病機制、免疫機制和未來疫苗的研制產生積極的推動作用。
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