檢測(cè)原理
試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)。往預(yù)先包被人類免疫缺陷病毒1型p24抗原(hiv-1 p24)捕獲抗體的包被微孔中,依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、hrp標(biāo)記的檢測(cè)抗體,經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物tmb顯色,tmb在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人類免疫缺陷病毒1型p24抗原(hiv-1 p24)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(od 值),計(jì)算樣品濃度。
樣品收集、處理及保存方法
1. 血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,收集血液后,3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿:edta、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液:3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。
5. 保存:如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè),請(qǐng)按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復(fù)凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品
酶標(biāo)儀(450nm)高精度加樣器及槍頭:0.5-10ul、2-20ul、20-200ul、200-1000ul37℃恒溫箱操作注意事項(xiàng)
試劑盒保存在2-8℃,使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶,這屬于正?,F(xiàn)象,水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再使用。 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。 預(yù)處理后的樣本無(wú)需稀釋,直接取10μl加樣即可。 嚴(yán)格按照說(shuō)明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。 所有液體組分使用前充分搖勻。試劑盒組成
名稱
96孔配置
48孔配置
備注
微孔酶標(biāo)板
12孔×8條
12孔×4條
無(wú)
標(biāo)準(zhǔn)品
0.3ml
0.3ml
無(wú)
樣本稀釋液
6ml
3ml
無(wú)
檢測(cè)抗體-hrp
10ml
5ml
無(wú)
20×洗滌緩沖液
25ml
15ml
按說(shuō)明書進(jìn)行稀釋
底物a
6ml
3ml
無(wú)
底物b
6ml
3ml
無(wú)
終止液
6ml
3ml
無(wú)
封板膜
2張
2張
無(wú)
說(shuō)明書
1份
1份
無(wú)
自封袋
1個(gè)
1個(gè)
無(wú)
注:標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為:8、4、2、1、0.5、0 ng/ml.
試劑的準(zhǔn)備
20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。
洗板方法
手工洗板:甩盡孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體,在吸水紙上拍干,如此洗板5次。 自動(dòng)洗板機(jī):每孔注入洗液350μl,浸泡1min,洗板5次。操作步驟
從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μl; 待測(cè)樣本孔先加待測(cè)樣本10μl,再加樣本稀釋液40μl; 隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(hrp)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μl,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。 棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板)。 每孔加入底物a、b各50μl,37℃避光孵育15min。 每孔加入終止液50μl,15min內(nèi),在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的od值。結(jié)果判斷
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:在excel工作表中,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)od值作縱坐標(biāo),繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線,按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。
試劑盒性能
準(zhǔn)確性:標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)r值,大于等于0.9900。 靈敏度:最低檢測(cè)濃度小于0.1 ng/ml。 特異性:不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。 重復(fù)性:板內(nèi)變異系數(shù)小于10%、板間變異系數(shù)小于15%
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